-----------------------------------------\ -- Планы на будущее -- Александров Павел Леонидович. Актуальная версия планов находится по адресу: http://alple.net/old/resalts/diary.txt См. также: Методики: http://alple.net/old/resalts/metch.txt Дневник: http://alple.net/old/resalts/diary.txt ____________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________ 12.01.2010 ##############1). Продолжать вести клетки, кроме зачёркнутых: HepG2-tr: клоны 3, 4 5, ShGFP ASPC-tr: все. Особенно надеяться на пятую. 2). Рассадить клетки: HEpG2-tr: ShGFP - отсадить на 3 см чашку. 293FT - рассадить на две 3 см чашки, в разведении 1:8 и 1:25, из той, где меньше. HepG2 - рассадить на 3 см чашку. 3). Подписать среды и растворы - с этикеткой. 4). К четвергу подготовить ретроспективную часть дневника. ##############5). При последующих обработках клеток записывать пассажи в дневник. 6). Переизмерить плазмиды на NanoDrop. Записать С, л260, л280. Сравнить С с полученной в резултьтате предыдущего измерения. Если не совпадает - доложить, предположительно, переделывать плазмиду. 7). Повторно поставить вирусную трансфекцию HepG2 (HepG2 брать не свой, а Машин). Использовать плазмиды GFP, ShGFP, 3, 4, 5. Повторно поставить вирусную трансфекцию ASPC1 (брать ASPC1, выведенную Графиней). ##############8). Окрасить клетки антителами на HNF4a1 и на HNF4a7. Необходимо окрасить клетки, трансфецированные интерферирующей плазмидой, и контрольные клетки (для ASPC в качестве контроля использовать нетрансфецированные клетки). ##############9). В случае положительного результата окрашивания - выделить из тех же линий клеток РНК и поставить ОТ-ПЦР с праймерами к HNF4a1 и HNF4a7. ##############10). В случае положительного результата ОТ-ПЦР - поставить RealTime-PCR с праймерами к HNF4a1 и HNF4a7. ##############11). В случае положительного результата RealTime-PCR - проводить дальнейшее исследование клеток. ____________________________________________________________________________________________________ 18.01.2010 1). Плашку с ASPC1 выкинуть. ##############2). С HepG2 - продолжать вести. 3). 293T - рассадить по 7 6-см чашкам (по 1e6 шт.) и 2 3-см (по шт). 4). Трансфецировать их PURO-r плазмидами (6-см) и pLSLG(3см). ##############5). Получить вирус, заразить им клетки. ##############6). Получить у Графини ASPC1-Sh. Морозить и красить. ____________________________________________________________________________________________________ 16.03.2010 1). HepG2: А). Вывести SiH3,4 Б). В четверг - поменять среду. В). В пятницу - посадить на Puro 2мкг/мл Г). В понедельник - снять. 2). ASPC-SiH4 убить 3). ASPC-SiH3 вести до пятницы, в пятницу посадить на Puro до понедельника. 4). Поставить вестерн на hnf4a7 - заново, красиво, с ASPC-SiH3 после Puro. 5). PCR-s: HNF1 (new или без примечаний) - на все 6 hP21 (обязательно h!) - на все 6 hAPOA4 - на HepG2 PPIA - на ASPC1 ____________________________________________________________________________________________________ 16.03.2010 Поставить ещё PCR - на HNF4a-tot (называется именно так) 65* 153b 24c и на HNF3g 64.5* 177b 25 cyk ____________________________________________________________________________________________________ 23.03.2010 До конца недели наращивать клетки - HepG2 c, si3,si4. На 10% FBS. Сделать новый RT, поставить GAPDH На следующей неделе: 1). В понедельник рассадить клетки: а). На пролиферацию (с бромдезоксиуридином или Мишей - в зависимости от результатов последнего). б). На репортёрные конструкции - во-первых, на люциферазу, во-вторых, если хватит - на RGFP ____________________________________________________________________________________________________ 30.03.2010 Поставить PCR: 1). Human AFP (по-идее, должен падать одновременно с а7). только h, 58*, 29c 2). Human C/EBPa, только h, 65*, 25c 3). Mouse Connexin (2 mismatch) => берём низкую Т, 63*, 18? 4). universal (m) CoupTF1, 65, 24 Вырастить плазмиду: pZL-HIVa1 В "бактерии-8", ряд 4, последние 6 штук. Вырастить, на midi-Prep. Окраска на Br-дезоксиуридин: Реактивы - в РНК-овой, в морозилке у окна, на второй полке сверху, в коробке "для клеточных культур". Развести на все клетки сразу, красить из одного разведённого стока. По инструкции. Ставить каждую 3см чашку в двух повторностях, если хватит клеток. Потом красить ту чашку, которая доживёт. 1). Во вторник посадить. 2). В четверг покрасить. 3). В пятницу посчитать. Тест на проползание В понедельник рассадить siGFP, SH3, SH4, если хватит - SH2 и SH5 - по два transwell на линию, по 5 и 15 тысяч. Во вторник - показать Графине, если понравится - красить и считать. Окрасить чашки siH2,H5 - старые, siH3,4 - новые - на HNF4tot. Стоит у Графини в морозилке, на плотике, рядом с антикозлом. Рассаживание: si2,5 - рассадить из чашек, подписанных Графиней, из 3см чашек. 6 см - на РНК. 3 см - остатки, на дорастание. 3 см, в капле - на окраску 3 см - на бромдезоксиуридин (в капле?) два трансвелла по 5 и 15 тыс. - на проползание. si3,4, siGFP 6 см - на дорастание. 3 см, в капле - на окраску 3 см - на бромдезоксиуридин (в капле?) два трансвелла по 5 и 15 тыс. - на проползание. Остальное - в центрифугу и в морозилку. ____________________________________________________________________________________________________ 07.04.2010 PCR: AFP: 58* 20c C/ebpA: 65* 20c HNF1: 60* 24c vHNF1 (=HNF1b): 65* 24c HNF4a7: 62*27c CX32: 63*23c +перенанести Hnf4tot +вставить в таблицу GAPDH. Рассадить: На BrdU - все, кроме siH1, по 200 тыс? на 3см. На клоногенный тест - все, по две 3см чашки - по 1000 и 2000. На окраску - все, кроме, возможно, siH1 - на 3см, в капле, в избытке. Остальные SiH1 - на 6см на дорост. Остальные остальные - на 3 Х 6см чашки - western, PCR и дорост. Клоногенный тест: Чашки на клоногенный тест убрать в термостат на две недели, доставать два раза в неделю для смены среды. Сразу после нанесения - показать Графине, для оценки точности подсчёта. Таки выделить плазмиду pZL-HIVa1. ____________________________________________________________________________________________________ 12.04.2010 Поставить PCR: hALB (это вообще печень или нет?) - 65*, 27с HNF4tot - 65*25c cx32 - 63*22c Поставить вестерн - hnf4tot ____________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________