-- Электронный дневник -- Александров Павел Леонидович. Актуальная версия дневника находится по адресу: http://alple.net/old/resalts/diary.txt См. также: Методики: http://alple.net/old/resalts/metch.txt Планы: http://alple.net/old/resalts/plans.txt ____________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________ 25.06.2009 Калибрую праймеры HNF4a1-L и HNF4-R по температуре(55-65*С). Получаются очень большое разнообразие. ____________________________________________________________________________________________ 26.06.2009 Калибрую праймеры HNF4a1-L и HNF4-R по температуре(59-66*С). Попробовал взять больше RT. Всё равно получаются очень большое разнообразие... ____________________________________________________________________________________________ 26.06.2009 Калибрую праймеры HNF4a1-L и HNF4-R по температуре(63.5-65.7*С). Получаются очень большое разнообразие... Как-то нестабильно всё... ____________________________________________________________________________________________ 30.06.2009 1). Поставил форез вчерашнего realtime. Выглядит нормально, только почему-то длинной 300б вместо 137. 2). Поставил рестрикцию. Должны были получиться отрезки 107+30б, получились длиннее... Что бы это значило? И может ли это быть связано с нестабильностью результатов? ____________________________________________________________________________________________ 01.07.2009 Ага, понятно. Это потому, что я вместо праймера HNF4HR взял HNF4R. Будем всё переделывать... [HNF4-HR] = 245 (257 по табл.) нг/мкл = 40 мкМ. Разбавляем в 15 раз. Концентрации РНК HepG2: 3.2.06 - 45.4 нг/мкл (260/280=2.08), 13.3.06 - 176 (2.09) ____________________________________________________________________________________________ 03.07.2009 Калибрую праймеры HNF4a1-L и HNF4-HR по температуре(60-65*С). Ура, сходится. ____________________________________________________________________________________________ 06.07.2009 На всякий случай повторил эксперимент 03.07, с меньшим диапазоном температур (62-65). Всё ок. Показанный рабочий диапазон - по крайней мере, 60-65*С Калибрую праймеры по концентрации кДНК. Результат - концентрация в целом не принципиальна, можно брать удобные на практике 2 мкл. ____________________________________________________________________________________________ 07.07.2009 - 16.07.2009 Отработано рытьё окопов, использование противогазов и ОЗК, сданы нормативы по применение ВПХР, ДП-5В, ИДК-в, развёртке АРС-14. Проведен также ряд оздоровительных и образовательных мероприятий. ____________________________________________________________________________________________ 18.08.2009 [RNA H33 17.02.2009]=279 нг/мкл. Поставлена Real-Time PCR на H33 на GAPDH и NHNF4a1. Показано отсутствие в h33 HNF4a1 (что, конечно, ожидаемо, но подтверждает применимость метода). Переставил RT H33: 120 мкл, 25 нг/мкл конечного RT. Измерил праймеры: HNF4a1L 145 нг/мкл 9.4 Х HNF4a7L 155 11.2 Х HNF4aHR 172 11.3 Х GAPDHL 173 11.6 Х GAPDHR 168 10.8 Х ____________________________________________________________________________________________ 19.08.2009 Проведена калибровка концентрации праймеров HNF4a1-L и HNF4-HR. Показано, что эффективность PCR мало зависит от концентрации праймеров (впрочем, некоторое преимущество имеет пара 2.5 мкл 2.5 мкМ HNF4a1-L + 5 мкл 2.5 мкМ HNF4-HR). Проведена калибровка чувствительности праймеров к HNF4a1 к специфической последовательности (плазмида с мышиным hnf4a) на фоне большой концентрации чужеродной ДНК (RT H33). ____________________________________________________________________________________________ 20.08.2009 Поставлена Real-Time калиброва Машиной РНК по GAPDH. Пробы - HepG2, HepG2+TGFb2. ОК. ____________________________________________________________________________________________ 21.08.2009 Поставлен Real-Time анализ Машиной РНК по HNF4a1. Пробы - HepG2, HepG2+TGFb2. ОК. HNF4a1 падает в 6 раз. ____________________________________________________________________________________________ 24.08.2009 Проведена калибровка эффективности и специфичности PCR на праймерах к HNF4a7 в зависимости от температуры. Показан рабочий диапазон 59-65.7*С ____________________________________________________________________________________________ 25.08.2009 РНК из панели H33, обработанных InhMEK: 40 мМ, 6ч - 386 нг/мкл 40 мМ, 24ч - 195 80 мМ, 6ч - 333 80 мМ, 24ч - 256 Ставим Real-Time калибровку по GAPDH моей панели РНК из H33, обработанных InhMEK. Концентрация РНК слишком высока. Ставим Real-Time калибровку по GAPDH моей панели РНК (разведение 50 раз) из H33, обработанных InhMEK. Лучше. Но теперь концентрация низковата. ____________________________________________________________________________________________ 26.08.2009 Ставим Real-Time калибровку по GAPDH моей панели РНК (разведение 12.5 раз) из H33, обработанных InhMEK. Разведение оптимально. ____________________________________________________________________________________________ 27.08.2009 Ставим Real-Time анализ экспрессии HNF4a1, HNF4a7 в моей панели РНК из H33, обработанных InhMEK. Показано отсутствие экспрессии. ____________________________________________________________________________________________ 28.08.2009 Машины РНК: PURE - 730 мкг/мкл - H33 c введённой пустой плазмидой. Si1 - 903 мкг/мкл - H33 c введённой плазмидой - SI к TGFb2, вар-т 1. Si2-1047 мкг/мкл - H33 c введённой плазмидой - SI к TGFb2, вар-т 2. Берём в RT по 50 нг/мкл. ____________________________________________________________________________________________ 31.08.2009 RNK (28.08) откалиброваны на GAPDH (Real-Time). Видимо, не очень удачно. ____________________________________________________________________________________________ 01.09.2009 RNK (28.08) проаналлизированны на содержание HNF4a1 и HNF4a7 (Real-Time). Соответствующая РНК не обнаружена. ____________________________________________________________________________________________ 02.09.2009 RNK (28.08) перекалиброваны на GAPDH (Real-Time). Проведена калибровка эффективности и специфичности PCR на праймерах к TGFb2 в зависимости от температуры. Выявленная рабочая температура - 63.2 - 65.6*С Праймеры TGFb2: L - 238ng/mkl (15.7 X) R - 160 (10.3 Х) ____________________________________________________________________________________________ 03.09.2009 RNK (28.08) проаналлизированны на содержание HNF4a1 и HNF4a7 (Real-Time). Обнаружены следы HNF4a1 в пробе Si1, следы HNF4a7 в пробе PURE и Si1. ____________________________________________________________________________________________ 04.09.2009 Машины РНК из мышиной панели: N C(ng/mkl) 1 476 2 1131 3 968 4 378 5 532 7 930 8 535 10 1199 11 1043 12 777 13 390 14 859 15 366 16 400 17 544 21 419 23 567 24 660 ____________________________________________________________________________________________ 05.09.2009 Поставлена Real-time калибровка на GAPDH и анализ на TGFb2 Машиной панели (см. 04.09.2009). Эксперимент не удался, очень большие расхождения в значениях. ____________________________________________________________________________________________ 08.09.2009 Повторён эксперимент от 05.09. Безрезультатно. ____________________________________________________________________________________________ 11.09.2009 Поставлен эксперимент по определению оптимальной концентрации GAPDH в пробе для Real-time. Показано, что оптимальной концентрацией является примерно 1E-4 мкг total-RNA на мкл смеси для PCR. Одновремено показана возможность использования стандарнтой методики и рекативов для получения RT вместо BioRad-овских. ____________________________________________________________________________________________ 15.09.2009 Проведён эксперимент, аналогичный проведённому 05.09, со следующими отличиями: - взяты только пробы 8, 10, 11, 14, 15, 16. - GAPDH разведён до концентрации 1E-4 мкг РНК на мкл смеси для PCR. В результате эксперимента показана достоверность данных, полученных Машей и Аней методом обчыного PCR. ____________________________________________________________________________________________ 16.09.2009 Анина РНК на HepG2 контроль - 196 мкг/мкл +tgfb2 - 403 Поставлена Real-Time калиброва Машиной РНК (другой) по GAPDH. Пробы - HepG2, HepG2+TGFb2. ОК. ____________________________________________________________________________________________ 17.08.2009 Поставлен Real-Time анализ Машиной РНК (другой) по HNF4a1 и HNF4a7. Пробы - HepG2, HepG2+TGFb2. ОК. HNF4a1 падает в 1.5 раза, HNF4a7 растёт в 2.5 раза. ____________________________________________________________________________________________ 21.09.2009 Поставлена Real-Time калиброва Аниной РНК по GAPDH. Пробы - HepG2, HepG2+TGFb2. ОК. Ставим Realtime на тройку Pure-Si1-Si2 из Аниной РНК. ____________________________________________________________________________________________ 23.09.2009 Поставлен Real-Time анализ Аниной РНК по HNF4a1 и HNF4a7. Пробы - HepG2, HepG2+TGFb2. ОК. HNF4a1 падает в 3.5 раза, HNF4a7 растёт в 5 раз. Ставим Realtime на тройку Pure-Si1-Si2 из Аниной РНК. Из другой. ____________________________________________________________________________________________ 24.09.2009 RNK (28.08) проаналлизированны на содержание TGFb2 (Real-Time). Показано девятикратное падение уровня TGFb2 в пробе Si1. RNK (28.08, новое RT ) проаналлизированны на содержание TGFb2 (Real-Time). Показано 20% падение уровня TGFb2 в пробе Si1 и очень существенное, но, возможно, не достоверное, падение уровня TGFb2 в пробе Si2. ____________________________________________________________________________________________ 25.09.2009 Поставлена Real-Time калиброва Аниной РНК (другой) по GAPDH. Пробы - HepG2, HepG2+TGFb2. Поставлен Real-Time анализ Аниной РНК (другой) по HNF4a1 и HNF4a7. Пробы - HepG2, HepG2+TGFb2. ОК. HNF4a1 падает в 6.7 раза, HNF4a7 растёт в 2.5 раз. В среднем a1 падает в 3.5 раз (AviDev 1.55), а7 - растёт в 3.75 раз (AD 1.25) (если не учитывать II попытку - 4.75 (AD 1.25) и 5 раз (AD 0)) Ставим Realtime на тройку Pure-Si1-Si2 из Аниной РНК. Из той же, что 23.09. ____________________________________________________________________________________________ 20.10.2009 - 01.11.2009 Наращивание культур клеток для трансфекции - 293FT, HepG2, ASPC1. ____________________________________________________________________________________________ 02.11.2009 Приготовление сред. Сбор и рассаживание клеток 293FT - в 8 3-см чашек и 1 6-см чашку. ____________________________________________________________________________________________ 03.11.2009 Поставлена трансфекция 293FT - плазмидами sh1-HNF4, sh2-HNF4, sh3-HNF4, sh4-HNF4, sh5-HNF4, pLKO1 (контроль PURO-r), shGFP (контроль PURO-r), pLSLG (контроль трансфекции, PURO-s). В чашках по 3 см. ____________________________________________________________________________________________ 04.11.2009 Снял трансфекционную среду и добавил нормальную (DMEM, 10% FBS). Рассадил HepG2 и ASPC1 в одну 24-луночную плашку, по 100тыс. клеток на лунку, по 9 лунок на линию. ____________________________________________________________________________________________ 05.11.2009 Поменял среду для 293FT. (DMEM, 10% FBS). Часть полученной среды добавил в плашку с HepG2 и ASPC1 (по 300 мкл + 300 мкл Игла или RPMI 10% FBS, остальное заморозил на -70. ____________________________________________________________________________________________ 06.11.2009 Поменял среду для 293FT. (DMEM, 10% FBS). Часть полученной среды добавил в плашку с HepG2 и ASPC1 (по 300 мкл + 300 мкл Игла или RPMI 10% FBS, остальное заморозил на -70. Светятся всё ещё плохо. ____________________________________________________________________________________________ 07.11.2009 Поменял среду для 293FT. (DMEM, 10% FBS). Часть полученной среды добавил в плашку с HepG2 и ASPC1 (по 300 мкл + 300 мкл Игла или RPMI 10% FBS, остальное заморозил на -70. Светятся всё ещё плохо. Оставил до понедельника. ____________________________________________________________________________________________ 09.11.2009 Снял среду среду 293FT. Чашки выкинул Часть полученной среды добавил в плашку с HepG2 и ASPC1 (по 300 мкл + 300 мкл Игла или RPMI 10% FBS, остальное заморозил на -70. Светятся всё ещё плохо. ____________________________________________________________________________________________ 10.11.2009 Пуромициновая селекция - по 0.5 мл 3 мкг/мкл PURO в бессывороточной ASPC/RPMI. ____________________________________________________________________________________________ 12.11.2009 Пуромициновая селекция - по 0.5 мл 3 мкг/мкл PURO в бессывороточной ASPC/RPMI. ____________________________________________________________________________________________ 13.11.2009 Все лишние клетки умерли. Большая часть нужных, судя по всему, тоже. Очень много мусора в чашках. Выращивание клеток после селекции: 1). промыть всю плашку бессывороточным DMEM (по 1 мл/лунку). 2). добавить в каждую лунку по 0.5 мл среды (Игла для HepG2 и RPMI для ASPC1) - с 20 % FBS, в остальном стандартной. ____________________________________________________________________________________________ 16.11.2009 Меняю среду, в каждую лунку по 0.5 мл среды (Игла для HepG2 и RPMI для ASPC1) - с 20 % FBS, в остальном стандартной. ____________________________________________________________________________________________ 18.11.2009 Меняю среду, в каждую лунку по 0.5 мл среды (Игла для HepG2 и RPMI для ASPC1) - с 20 % FBS, в остальном стандартной. ____________________________________________________________________________________________ 20.11.2009 Меняю среду, в каждую лунку по 0.5 мл среды (Игла для HepG2 и RPMI для ASPC1) - с 20 % FBS, в остальном стандартной. Вроде всё хорошо, появляются клоны. ____________________________________________________________________________________________ 23.11.2009 Позвонила Даша Флейшман, сказала, что всё плохо и всё надо переделывать. Сняла HepG2 Sh2 и SH4, Sh3 оставила "вдруг вырастет". ASPC1 оставила все, есть шансы у Sh2, Sh3, Sh4. Меняю среду, в каждую лунку по 0.5 мл среды (Игла для HepG2 и RPMI для ASPC1) - с 20 % FBS, в остальном стандартной. Рассадил 293FT для следующей трансфекции (см. 03.11.2009). ____________________________________________________________________________________________ 24.11 - 04.12 - всё то же, что и 04.11 - 18.11 За это время HepG2-Sh3 и ASPC1-Sh2 умерли окончательно. 01.12 нашёл гриб во всех чашках с HepG2. К счастью, PURO действует и на грибы, так что за время селекции они благополучно умерли. Остались только в 6 см. чашке, в которой я вёл базовую линию. ____________________________________________________________________________________________ 05.12.2009 Уточнил состояние клеток с помощью инвертоскопа: HepH2-Sh2-1: в хорошем состоянии. HepH2-Sh4-1: в плохом состоянии, на отдельной чашке. Возможно, выживет. ASPC-Sh3-1, ASPC-Sh4-1 - в плашке, в плохом состоянии. HepG2 второй трансфекции - от гриба, видимо, спасина. ASPC1 второй трансфекции - ок. ____________________________________________________________________________________________ 07.12.2009 Сменил среду (20% FBS) Рассадил клетки на трансфекцию - 293FT, 2 x 3 cm. Рассадил клетки HepH2-Sh2-1 - на две 3см чашки для окраски и одну 6см для поддержания культуры. ____________________________________________________________________________________________ 09.12.2009 Сменил среду (20% FBS) Поставил трансфекцию - в двух чашках, в одной старый CaCl2, в другой - новый (Дашин). Обе - на PLSLG. Окрасил клетки HepH2-Sh2-1 (в качестве контрлоля взял HepG2, в котором рос гриб). Показано подавление активности генов HNF4a1 и HNF4a7. ____________________________________________________________________________________________ 11.12.2009 Сменил среду (20% FBS) Клетки выглядят немного странно, там какие-то точечьки плавают... Вчерашняя трансфекция светится замечательно. Порадовался и выкинул. HepH2-Sh2-1 в шестисантиметровой чашке не выжили - видимо, их было слишком мало, а чашка - слишком большая. ____________________________________________________________________________________________ 13.12.2009 Точечек очень много. Показал Наташе, сказала срочно выкинуть. На всякий случай оставил до завтра. ____________________________________________________________________________________________ 14.12.2009 Показал Графине плавающие точечки. Она сказала выкинуть и ставить заново. Ставлю трансфекцию №3. 1). Использую новую культуру 293T для выделения нового вируса. 2). По возможности использую только стеклянные и запечатанные пластиковые пипетки. 3). Ставлю ASPC1 и HepG2 в разные плашки. 4). Для трансфекции использую Дашины плазмиды. Потому что остальные кончились. В остальном - как 03.11.2009 ____________________________________________________________________________________________ 15.12.2009 Поменял среду с трансфекционной на обычную. Поговорил с Графиней, узнал, что в трансфекционную среду, оказывается, надо было добавлять сыворотку. Добавил первую порцию вируса в плашки с ASPC1 и HepG2. ____________________________________________________________________________________________ 16.12.2009 Клетки ещё не светятся. Добавил вторую порцию вируса Посадил бактерии для выделения плазмиды: Из коробки "бактерии-7": А2 - pLSLG. Из коробки "бактерии-3": А4 - pLP2 A5 - pVSVG C5 - pLP1 ____________________________________________________________________________________________ 17.12.2009 Клетки, вроде, начали светиться. Выделил плазмиды (см. 16.12). ____________________________________________________________________________________________ 18.12.2009 добавил третью порцию вируса. ____________________________________________________________________________________________ 19.12.2009 Сменил среду на 3 мкг/мл Puro (бессыв., Игла и RPMI) ____________________________________________________________________________________________ 21.12.2009 Перевёл HepG2 на 20% FBS, ASPC1 - на 20%FBS+1.5 мкг/мкл Puro. ____________________________________________________________________________________________ 23.12.2009 Перевёл ASPC на 20% FBS. ____________________________________________________________________________________________ 24.12.2009 - 11.01.2010 Трансфецированные HepG2 и ASPC1 содержались на 20% FBS. ____________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________ 12.01.2010 Клетки переосли и стали умирать - то ли от перероста, то ли не выдержали три дня без смены среды. Реанимируются. 1). Переделал этикетки на бутылки со средой. 2). Измерил концентрации плазмид. В целом, совпадают с предыдущими: Pl C 260/280 260/230 SH1 331 1.89 2.09 SH2 294 1.88 2.16 SH3 145 1.82 1.95 SH4 327 1.89 2.16 SH5 373 1.86 2.12 Plko1 389 1.89 2.27 SHGFP 260 1.89 2.26 3). Рассадил клетки: HepG2-tr: ShGFP - отсадить на 3 см чашку. 293FT - рассадить на две 3 см чашки, в разведении 1:8 и 1:25, из той, где меньше. HepG2 - рассадить на 3 см чашку. ____________________________________________________________________________________________ 13.01.2010 Оформлял дневник. ____________________________________________________________________________________________ 14.01.2010 Оформлял дневник, менял среду. 293T выглядят пристойно, остальные плохо, но, возможно, не безнадёжно. ____________________________________________________________________________________________ 15.01.2010 Оформлял дневник - ретроспективную часть, посвящённую Real-Time PCR. Графиня говорит, что у клеток, вроде, есть шансы. ____________________________________________________________________________________________ 16.01.2010 Поменял среду клеткам. Вроде, относительно живые. ____________________________________________________________________________________________ 18.01.2010 Выкинул плашку с ASPC1. 293T рассадил на 2X 6см чашек. Было два миллиона, как наберётся семь (20 числа?) - поставлю следующую трансфекцию. HepG2 - Машин дохнет. Пока рассадил свою. Остальные, вроде, потихоньку оживают. HepG2 в плашке - скорее всего, больше не нужны, но на всякий случай не буду выкидывать, пока не будут заморожены те, что на чашках. ____________________________________________________________________________________________ 19.01.2010 Всё ОК. Менял среду, с Машей сливали воду из автоклава через отверстие, для него не предназначенное. Когда слили - пришла Графиня и сказала, как надо. ____________________________________________________________________________________________ 20.01.2010 Всё ОК. Менял среду. Доделывал автоклав. ____________________________________________________________________________________________ 21.01.2010 Ок. 15:00 Рассадил 293T (посажен XI пассаж) для трансфекции (8 Х 6 см по 1 млн, 2 Х 3 см по 100-300 тыс.) Рассадил ASPC1 SH4-3 на две чашки - 3 и 6 см. Ок. 20:00 Поставил трансфекцию 293FT (В соответствии с полученной инструкцией). Пакующие плазмиды брал из большого штатива. ____________________________________________________________________________________________ 22.01.2010 PLSLG светится "звёздным небом". Снял среду, отфильтровал (хотя Графиня потом сказала, что лучше бы слить, чтобы не в пробирку попали остатки CaCl2. Но если уж слил - то не страшно). ASPC1-SH3 подозрительно быстро рос. Графиня сказала, что он, действительно, похож на 293T, и посоветовала выкинуть, и дала новую чашку. ____________________________________________________________________________________________ 23.01.2010 Снял вирус. ____________________________________________________________________________________________ 25.01.2010 Последний раз снял вирус, выбросил чашки. Пересеил 293T. Пересеил ASPC1 (на 9 см) и ASPC1-SH4-3 (на 3 + 6 см). ____________________________________________________________________________________________ 29.01.2010 Рассаживал клетки: 293T, HepG2-SH4-3, HepG2-SH4-4 - продолжаю вести. ASPC1-SH4-4 и HepG2-SiGFP - пересадил с 3см на 6 см чашку. ASPC1-SH4-3, ASPC1 и HepG2 - пересадил с 6 см на 6 см чашку. HepG2 (2 6 см, 52-й пассаж включая сегодняшний) и ASPC1 (9 см, 13-й пассаж включая сегодняшний) - рассадил на 9 шт 3 см чашек каждую по 150 тыс клет. на чашку. ASPC1-SH4-4 с 6 см чашки, а также остатки ASPC1-SH4-3 и ASPC1 с шестисантиметровых и ASPC1 с девятисантиметровой чашки - заморозил для РНК. ____________________________________________________________________________________________ 01.02.2010 Рассаживал клетки: Пересадил клетки: HepG2 (SH4-3, SH4-4, SiGFP)6 см -> 3 см; ASPC1-SH4-4 6 см -> 6см чашку. Выделил РНК из клеток ASPC1-SH4-3. Promega, по методике, пипетировал лизат 5 мл шприцом. ____________________________________________________________________________________________ 03.02.2010 Выделил РНК из остальных клеток. Концентрации (в нг/мкл): ASPC1: K - 456 SiH4-3 - 318 SiH4-4 - 59.2 HepG2: SiGFP - 205 SiH4-3 - 258 SiH4-4 - 313 Поставил RT по 0.67 мкг РНК на 20 мкл RT. Сменил среду с вирусом ____________________________________________________________________________________________ 05.02.2010 Поставил PCR на GAPDH (по 3 мкл неразбавленного RT - забыл разбавить). Развёл RT с 17 до 57 мкл (т.е. до 10 нг РНК на 1 мкл RT) ____________________________________________________________________________________________ 06.02.2010 GAPDH более-менее получился. Поставил PCR на HNF4a1-7. Ничего не видно, доцикливаю. ____________________________________________________________________________________________ 07.02.2010 Поставил Real-Time PCR на GAPDH (по 1.25 нг РНК на пробу). PCR на HNF4a1 - ОК. a7 - не видно. доцикливаю A7 ____________________________________________________________________________________________ 08.02.2010 a7 всё равно не видно. Переставил PCR с новыми праймерами (те были очень подозрительными) Поменял Пуромицин на клетках. ____________________________________________________________________________________________ 09.02.2010 A7 видно, но я решил ещё доциклить. Пересадил отселектированные HepG2. Правда, Графиня сказала, что лучше было их сначала подержать пару дней на старых чашках, просто без пуромицина. Но было поздно. ____________________________________________________________________________________________ 10.02.2010 Поставил Real-Time на a1-a7. ____________________________________________________________________________________________ 18.02.2010 Перевыделил РНК из ASPC1-SiH4-4 от Графини. ____________________________________________________________________________________________ 19.02.2010 Поставлил RT-PCR по данным Real-time. Получилось странно. ____________________________________________________________________________________________ 20.02.2010 Показал результаты PCR-ов Графине. Сказала, что всё очень странно и надо переделать. ____________________________________________________________________________________________ 24.02.2010 Переставил все RT. Поставил Real-Time. ____________________________________________________________________________________________ 25.02.2010 По результатам Real-Time поставил PCR (2.00 3.11 2.89 2.00 4.60 4.25). Пока результаты не смотрел - люминометр не работает. ____________________________________________________________________________________________ 26.02.2010 Пытался настроить люминометр. Выяснил, что Мишина XP-64 плохо реагирует на выставление часов. ____________________________________________________________________________________________ 01.03.2010 Пытался настроить люминометр. Выяснил, что драйвер ключа для LTE-DOC устанавливается в досовском режиме. Поэтому в XP-64 он не работает. А более новая версия драйвера не работает с программой. ____________________________________________________________________________________________ 02.03.2010 Настраивал люминометр. Убрал XP-64, поставил XP. Теперь всё работает. Сделал автоматическую загрузку и настройку люминометра. ____________________________________________________________________________________________ 03.03.2010 Посмотрел результаты PCR. Получилось очень криво. Сел перепроверять результаты Real-Time PCR. Нашёл ошибку в рассчётах. Переставил PCR с использованием эмпирических коэффицентов (1 2 3.5 2 4.6 3). ____________________________________________________________________________________________ 04.03.2010 Посомтрел результат вчерашнего PCR. Показано отсутствие изменения активности транскрипцияя HNF4a1-7 в клетках, продуцирующих siHNF4. Выделил белки, поставил Western-blot на тубулин. Белок выделился везде, кроме контрольных HepG2-SiGFP, вместо них буду ставить HepG2. Используемые объёмы: 7-3-5-3-4-4 мкл. ____________________________________________________________________________________________ 05.03.2010 Поставил Western-blot на HNF4a1-a7 + tub. Выравнивание по тубулину нормальное, но a1-a7 не прокрасились. Возможно, дел о в том, что первичные антитела использовались уже в третий раз. ____________________________________________________________________________________________ 10.03.2010 Перекрасил блоты на a1-a7. Безрезультатно. ____________________________________________________________________________________________ 11.03.2010 Переставил блоты на a1-a7. Безрезультатно. ____________________________________________________________________________________________ 12.03.2010 Показал неудачные постановки. Мне так и не объяснили, в чём дело. Начал ставить заново, под присмотром Даши. ____________________________________________________________________________________________ 15.03.2010 Закончил ставить под присмотром Даши. Найденные проблемы: 1). После высыхания мембраны нужно смачивать в метаноле. 2). При окраске не допускаются даже кратковременные высыхания мембраны. 3). Отмывку от антител лучше проводить не меньше 15 минут (лучше 15 мин в 100 мл + 3х5) Рассадил клетки по 50 тыс. на 3см чашку (хотел больше, но запутался с камерой Горяева). ____________________________________________________________________________________________ 16.03.2010 Дорассадил клетки до 150 тыс. на чашку. Перекрасил вестерн на Тубулин. Всё ОК. Результат: HepG2 - оба хорошие, ASPC1 - может быть, siH3 хорошая. ____________________________________________________________________________________________ 17.03.2010 Графиня вывела клетки: HepG2 SiGFP 5.12.02.2010 HepG2 SiH3 5.04.02.2010 HepG2 SiH4 4.05.02.2010 Поставлена трансфекция: Клетки: по 150'000/3см ASPC 19.16.03.2010 HepG2 18.16.03.2010 Вирусы: SiHNF4-1,2,3,4,5; pLKo, SiGFP, pLSG, Pure - выделенные 25.01.2010 Ставит Графиня, так что всё должно получиться. ____________________________________________________________________________________________ 18.03.2010 Поставил PCR-Ы: HNF1 - на все 6 - не удалось hP21 - на все 6 - без изменений hAPOA4 - на HepG2 - без изменений PPIA - на ASPC1 - без изменений ____________________________________________________________________________________________ 19.03.2010 Пересадил HepG2SiH4-3,4, ASPC1siH4-3 на 2 мкг/мкл Puro. До понедельника. Переставил PCR на HNF1. Картина странная - почти всё без изменений, только HepG2-si-H3 - упало до нуля. H4 - тоже без изменений... ____________________________________________________________________________________________ 22.03.2010 Переставил всех с пуромицина на обычную среду. Снял с двух чашек переселекционированный ASPC1-siH4-3. Посмотрел, как Миша считает подвижность клеток. ____________________________________________________________________________________________ 23.03.2010 Поставил PCR на HNF4-еще (Показано незначительное падение уровня транскрипции в HepG2-sh3, sh4) и на HNF3g (Показано ещё менее значительное падение уровня транскрипции в HepG2-sh3, sh4). ____________________________________________________________________________________________ 24.03.2010 Провёл праздничные мероприятия. ____________________________________________________________________________________________ 25.03.2010 Поставил новый RT, провёл PCR. ____________________________________________________________________________________________ 26.03.2010 Переставил PCR, добился выравнивания. ____________________________________________________________________________________________ 29.03.2010 Добился равномерного зарастания чашек клетками. ____________________________________________________________________________________________ 30.03.2010 Рассадил клетки: Рассаживание: si2,5 - рассадить из чашек, подписанных Графиней, из 3см чашек. 6 см - на РНК. 3 см - остатки, на дорастание. 3 см, в капле - на окраску 3 см - на бромдезоксиуридин по 125 тыс. два трансвелла по 5 и 15 тыс. - на проползание. si3,4, siGFP 6 см - на дорастание. 3 см, в капле - на окраску 3 см - на бромдезоксиуридин по 125 тыс. два трансвелла по 5 и 15 тыс. - на проползание. В трансвеллы сажал клетки на сывороточной среде. Просто не знал, что при разбалении в десять раз она на что-то повлияет. ____________________________________________________________________________________________ 31.03.2010 Посмотрел один трансвелл - ничего не проползло. Поставил PCR Поставить PCR: 1). Human AFP (по-идее, должен падать одновременно с а7). только h, 58*, 29c 2). Human C/EBPa, только h, 65*, 25c 3). Mouse Connexin (2 mismatch) => берём низкую Т, 63*, 20 4). universal (m) CoupTF1, 65, 24 проавтоклавировал носики и среду для бактерий. Посадил pZL-HIVa1 ____________________________________________________________________________________________ 01.04.2010 Посмотрел вчерашний PCR - ничего хорошего, надо переставлять. Посмотрел трансвеллы - ничего хорошего, надо переставлять. Количество проползших клеток обратно пропорционально количеству среды с сывороткой, в которой они были налиты. siGFP-5тыс - 91 шт siGFP-15тыс - 73 шт siHNF4-2-5тыс - 73 шт siHNF4-2-15тыс - 28 шт siHNF4-3-5тыс - 101 шт siHNF4-3-15тыс - 64 шт siHNF4-4-5тыс - 78 шт siHNF4-4-15тыс - 79 шт siHNF4-5-5тыс - 38 шт siHNF4-5-15тыс - 20 шт Зафиксировал клетки для окраски на Бромдезоксиуридин. ____________________________________________________________________________________________ 02.04.2010 Окрасил клетки на бромдезоксиуридин. Зафиксировал клетки для окраски на HNF4tot. ____________________________________________________________________________________________ 05.04.2010 Посчитал клетки на бромдезоксиуридин. Результаты: SiGFP (c): 34% из 1388 шт.окрашены SiHNF4-2: 20% из 1448 шт.окрашены SiHNF4-3: 26% из 1514 шт.окрашены SiHNF4-4: 45% из 1027 шт.окрашены SiHNF4-5: Окраска не удалась. Окрасил клетки на HNF4tot. Поставил ряд PCR. ____________________________________________________________________________________________ 06.04.2010 Результат окраси на HNF4tot неудоволетворительный. Оптимизировал поставленные PCR. ____________________________________________________________________________________________ 07.04.2010 Обсудил планы с Графиней. Рассадил клетки. ____________________________________________________________________________________________ 07.04.2010 Добавил к клетам BrdU. Зафиксировал их и клетки на HNF4a1. ____________________________________________________________________________________________ 08.04.2010 Окрасил клетки на Brdu и на HNF4a1. Залил эльванелом и оставил до выходных. ____________________________________________________________________________________________ 09.04.2010 Выделил плазмиду pZL-HIVa1, 77 мг/л, 300 мкл. ____________________________________________________________________________________________ 12.04.2010 выделил РНК - siGFP, plko, siH4-2, siH4-3, siH4-4, siH4-5 ____________________________________________________________________________________________ 13.04.2010 Померил концентрацию РНК. Получилось siGFP 153 мг/л plko 165 мг/л siH4-2 105 мг/л siH4-3 168 мг/л siH4-4 193 мг/л siH4-5 127 мг/л Посмотрел клетки, окрашенные на HNF4a1. Большой разницы между клонами не увидел. Посмотрел клетки, покрашенные на BrdU SiGFP (c): 29%, 7 пассаж. SiHNF4-1: 45%, 4 пассаж. SiHNF4-2: 20%, 3 пассаж. SiHNF4-3: 45%, 9 пассаж. SiHNF4-4: 39%, 8 пассаж. SiHNF4-5: 30%, 3 пассаж. ____________________________________________________________________________________________ 14.04.2010 Поставил western. На тубулин. Для следующих реакций брать по: SiGFP (c): 4 мкл. SiHNF4-2: NAN. SiHNF4-3: 3 мкл. SiHNF4-4: 3 мкл. SiHNF4-5: 4 мкл. Как следствие - завтра снимаю новые клетки siHNF4-2 и переставляю western на тубулин с ними. ____________________________________________________________________________________________