-- Методические указания -- Александров Павел Леонидович. Актуальная версия методических указаний находится по адресу: http://alple.net/old/resalts/metch.txt См. также: Дневник: http://alple.net/old/resalts/diary.txt Планы: http://alple.net/old/resalts/plans.txt _______________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ ПЕРЕСАЖИВАНИЕ КЛЕТОК ИЗ 1.5 СМ ЛУНКИ 1). Пересадить (см) на 3 см. чашку. 2). Пересадить на 6 см чашку и 3 см. чашку. В случае необходимости также добавить по капле клеток в центр нескольких 3 см чашек для последующей окраски антителами. 3). Клетки с 6 см чашки рассадить на две пробирки и заморозить (см). Оставшуюся чашку залить средой. 4). Клетки с 3 см чашки рассадить на одну-две 6см чашки. Далее использовать по мере надобности. 5). Клетки с 6 см чашки (из п. 3) рассадить на две пробирки и заморозить. _______________________________________________________________________________________________ ВЫДЕЛЕНИЕ РНК ИЗ МОРОЖЕННОЙ ТКАНИ А всё сначала протиратьв спирте. 1). Взять материал. 2). бросить пробирки в азот. 3). бросить гомогенизатор в азот. 4). Гомогенизатор помыть в спирте - сунуть ваттку со спиртом. расттетреть. Вытеретть сухой. 5). протереть шпатель спиртом. 6). ~30 мг в гомогенизаторе (остатки - в морозилку). 7). долбить и растирать пестиком, время от времени перемешивая шпателем. Время от времени окунать в азот. 8). набрать пробу в эпиндорофку (объём ~ конус на дне двухкубовой пробирки, чуть больше). 9). Подписать. 10). Выделять рнк как обычно. Только на этапе лизиса очень долго пипетироватть, т. к. обрывки тканей. _______________________________________________________________________________________________ ПЦР (не real-time) Работать в боксе, по возможности стерильно. Смесь ПЦР: буфер 2.5 мкл. dNTP - 0.5 мкл праймер (RL смесь) - 0.5 мкл TAQ (вытаскивать из морозильника только на время добавления) - 0.25 __ПРОБА RT - по надобности___ Вода - до 25 мкл. Обычно в проба - ~3 мкл - выбирается так, чтобы во всех ПЦР данной партии был одинаковая масса РНК (обычно ~2 мкг). Дальше закрыть, подписать, перемешать, поставить в прибор и запустить нужную программу. Если используется аппарат без подогрева крышки - добавить 30 мкл масла и проследить, чтобы растеклось по всей поверхности жидкости. Программа PCR: 10 95*C 10 мин. первичная денатурация. 20 95*С 50 сек. денатурация 30 ХХХ*С 50 сек. Отжиг. ХХХ - ТЕМПЕРАТУРА, ЗАВИСИТ ОТ ПРАЙМЕРА. СМ. В ТАБЛИЦЕ. 40 72*С 50 сек. Элонгация цепи. 50 GOTO 20 YYY раз. YYY+1 - КОЛИЧЕСТВО ЦИКЛОВ, ЗАВИСИТ ОТ ПРАЙМЕРА. 60 72*С 10 мин. отжиг 70 6*С <><> хранение. _______________________________________________________________________________________________ ПОСАДКА БАКТЕРИЙ на чашку. 1). взять чашки с разлитым LB-Агаром. Подписать. 2). Налить в стеклянный стаканчик спирт. 3). Окунуть в спирт и прожечь треугольную стеклянную петлю. 4). Выдохнуть пипетку в огонь, забрать бактерий из пробирки, капнуть на чашку. 5). размазывать до высыхания петлёй. Если не долго не сохнет - неплотно прикрыть крышкой и поставить ближе к огню. 6). Закрыть крышкой, перевернуть. 7). Если осталиьс лишние чашки с агаром - обмотать парафильмом и убрать в холодильник. _______________________________________________________________________________________________ ТРАНСФОРМАЦИЯ БАКТЕРИЙ взять лёд Взять z-компетентные клетки (морозилка на 4 этаже) разморозить клетки на льду. Охладить и подписать пробирки. смешать с днк (обычно 3 мкл днк + 30 мкл клеток) инкубировать в холодильнике 30 мин. посадить на чашки. _______________________________________________________________________________________________ ЗАМОРОЗКА БАКТЕРИЙ. Подписать пробирки. Взять жидкий азот. Обрезать кончик у 1 мл ноиска. В каждую пробирку - по 150 мкл глицерина (лучше по шкале пробирки) Добавить по 750 мкл клеток, перемешать. Бросить в азот. Убрать на -70*С _______________________________________________________________________________________________ Приготовление жидкого LB 1). Взять чистую бутылку, насыпать LB (без агара) Обычно 20-25 г/л (4-7.5 г/бутылку) - столько, сколько написано на банке. 2). Долить 200-300 мл дистиллята. _______________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________