-----------------------------------------\
-- Планы на будущее --
Александров Павел Леонидович.

Актуальная версия планов находится по адресу: http://alple.net/old/resalts/diary.txt

См. также:

Методики: http://alple.net/old/resalts/metch.txt
Дневник: http://alple.net/old/resalts/diary.txt

____________________________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________________________
12.01.2010

##############1). Продолжать вести клетки, кроме зачёркнутых:
HepG2-tr: клоны 3, 4 5, ShGFP
ASPC-tr: все. Особенно надеяться на пятую.

2). Рассадить клетки:
HEpG2-tr: ShGFP - отсадить на 3 см чашку.
293FT - рассадить на две 3 см чашки, в разведении 1:8 и 1:25, из той, где меньше.
HepG2 - рассадить на 3 см чашку.

3). Подписать среды и растворы - с этикеткой.

4). К четвергу подготовить ретроспективную часть дневника.

##############5). При последующих обработках клеток записывать пассажи в дневник.

6). Переизмерить плазмиды на NanoDrop. Записать С, л260, л280. Сравнить С с полученной в резултьтате предыдущего измерения. Если не совпадает - доложить, предположительно, переделывать плазмиду.

7). Повторно поставить вирусную трансфекцию HepG2 (HepG2 брать не свой, а Машин). 
Использовать плазмиды GFP, ShGFP, 3, 4, 5.
Повторно поставить вирусную трансфекцию ASPC1 (брать ASPC1, выведенную Графиней).

##############8). Окрасить клетки антителами на HNF4a1 и на HNF4a7. Необходимо окрасить клетки, трансфецированные интерферирующей плазмидой, и контрольные клетки (для ASPC в качестве контроля использовать нетрансфецированные клетки).

##############9). В случае положительного результата окрашивания - выделить из тех же линий клеток РНК и поставить ОТ-ПЦР с праймерами к HNF4a1 и HNF4a7.

##############10). В случае положительного результата ОТ-ПЦР - поставить RealTime-PCR с праймерами к HNF4a1 и HNF4a7.

##############11). В случае положительного результата RealTime-PCR - проводить дальнейшее исследование клеток.
____________________________________________________________________________________________________
18.01.2010

1). Плашку с ASPC1 выкинуть.

##############2). С HepG2 - продолжать вести.

3). 293T - рассадить по 7 6-см чашкам (по 1e6 шт.) и 2 3-см (по шт).

4). Трансфецировать их PURO-r плазмидами (6-см) и pLSLG(3см).

##############5). Получить вирус, заразить им клетки.

##############6). Получить у Графини ASPC1-Sh. Морозить и красить.
____________________________________________________________________________________________________
16.03.2010

1). HepG2:
А). Вывести SiH3,4
Б). В четверг - поменять среду.
В). В пятницу - посадить на Puro 2мкг/мл
Г). В понедельник - снять.

2). ASPC-SiH4 убить

3). ASPC-SiH3 вести до пятницы, в пятницу посадить на Puro до понедельника.

4). Поставить вестерн на hnf4a7 - заново, красиво, с ASPC-SiH3 после Puro.

5). PCR-s:
HNF1 (new или без примечаний) - на все 6
hP21 (обязательно h!) - на все 6
hAPOA4 - на HepG2
PPIA - на ASPC1
____________________________________________________________________________________________________
16.03.2010

Поставить ещё PCR - 
на HNF4a-tot (называется именно так) 65* 153b 24c
и на HNF3g 64.5* 177b 25 cyk
____________________________________________________________________________________________________
23.03.2010

До конца недели наращивать клетки - HepG2 c, si3,si4. На 10% FBS.
Сделать новый RT, поставить GAPDH

На следующей неделе:
1). В понедельник рассадить клетки:
  а). На пролиферацию (с бромдезоксиуридином или Мишей - в зависимости от результатов последнего).
  б). На репортёрные конструкции - во-первых, на люциферазу, во-вторых, если хватит - на RGFP
____________________________________________________________________________________________________
30.03.2010

Поставить PCR:
1). Human AFP (по-идее, должен падать одновременно с а7). только h, 58*, 29c
2). Human C/EBPa, только h, 65*, 25c
3). Mouse Connexin (2 mismatch) => берём низкую Т, 63*, 18?
4). universal (m) CoupTF1, 65, 24

Вырастить плазмиду:
pZL-HIVa1
В "бактерии-8", ряд 4, последние 6 штук.
Вырастить, на midi-Prep.

Окраска на Br-дезоксиуридин:
Реактивы - в РНК-овой, в морозилке у окна, на второй полке сверху, в коробке "для клеточных культур".
Развести на все клетки сразу, красить из одного разведённого стока.
По инструкции.
Ставить каждую 3см чашку в двух повторностях, если хватит клеток. Потом красить ту чашку, которая доживёт.
1). Во вторник посадить.
2). В четверг покрасить.
3). В пятницу посчитать.

Тест на проползание
В понедельник рассадить siGFP, SH3, SH4, если хватит - SH2 и SH5 - по два transwell на линию, по 5 и 15 тысяч. 
Во вторник - показать Графине, если понравится - красить и считать.

Окрасить чашки siH2,H5 - старые, siH3,4 - новые - на HNF4tot. Стоит у Графини в морозилке, на плотике, рядом с антикозлом.

Рассаживание:
si2,5 - рассадить из чашек, подписанных Графиней, из 3см чашек.
6 см - на РНК.
3 см - остатки, на дорастание.
3 см, в капле - на окраску
3 см - на бромдезоксиуридин (в капле?)
два трансвелла по 5 и 15 тыс. - на проползание.

si3,4, siGFP
6 см - на дорастание.
3 см, в капле - на окраску
3 см - на бромдезоксиуридин (в капле?)
два трансвелла по 5 и 15 тыс. - на проползание.
Остальное - в центрифугу и в морозилку.

____________________________________________________________________________________________________
07.04.2010

PCR:
AFP: 58* 20c
C/ebpA: 65* 20c
HNF1: 60* 24c
vHNF1 (=HNF1b): 65* 24c
HNF4a7: 62*27c
CX32: 63*23c
+перенанести Hnf4tot 
+вставить в таблицу GAPDH.

Рассадить:
На BrdU - все, кроме siH1, по 200 тыс? на 3см.
На клоногенный тест - все, по две 3см чашки - по 1000 и 2000.
На окраску - все, кроме, возможно, siH1 - на 3см, в капле, в избытке.
Остальные SiH1 - на 6см на дорост.
Остальные остальные - на 3 Х 6см чашки - western, PCR и дорост.

Клоногенный тест: Чашки на клоногенный тест убрать в термостат на две недели, доставать два раза в неделю для смены среды. Сразу после нанесения - показать Графине, для оценки точности подсчёта.

Таки выделить плазмиду pZL-HIVa1. 

____________________________________________________________________________________________________
12.04.2010

Поставить PCR:
hALB (это вообще печень или нет?) - 65*, 27с
HNF4tot - 65*25c
cx32 - 63*22c

Поставить вестерн - hnf4tot

____________________________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________________________